2022年8月，复旦大学附属中山医院检验科郭玮教授团队在国际临床化学与检验医学协会（IFCC）官方杂志Clin Chim Acta (CCA)上发表了重要研究成果，在肺癌患者临床队列中验证了ctDNA检测新技术“BDA Sanger” 检测EGFR突变的价值，为ctDNA检测提供了新的思路与策略。
循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是指脱落进循环系统的肿瘤DNA片段，作为液体活检标志物之一，在肿瘤伴随诊断、耐药检测、疾病监测及早诊早筛等方面都发挥着重要作用。在肺癌的临床诊疗中，ctDNA EGFR突变检测指导靶向治疗的可行性已得到充分证实。ctDNA通常由40-200个bp的双链DNA组成，在肿瘤患者体内的含量存在较大差异（占cfDNA的0.01%~90%不等）。由于ctDNA在血液中的含量相当低，对于检测技术的灵敏度要求很高；此外，ctDNA变异的类型多种多样，对检测技术的覆盖范围也提出了挑战。目前，ctDNA检测方法主要分为两大类，一类是基于PCR技术的super-ARMS、ddPCR、BEAMing等，另一类是二代测序（Next Generation Sequenceing, NGS）。这些方法在检测灵敏度、特异性和覆盖范围方面存在显著差异。PCR技术流程简便快速，成本较低，但只能识别已知的突变。而NGS技术虽然检测范围更广，但测序流程及数据分析难度大，检测周期更长，成本也相对较高。在ctDNA检测技术的创新研发过程中，我们始终在寻找一种平衡检测性能、成本、效率的新方法。作为一代测序的Sanger技术，自1975年由Frederick Sanger发明至今，已经历近50年的发展，如今依然是测序的金标准。然而Sanger测序始终未被应用于ctDNA的检测，主要是因为Sanger测序的灵敏度仅为15%左右，而ctDNA的突变频率在很多情况下都低于15%，因此，需要联合一些低频检测技术才能使得Sanger测序的灵敏度达到ctDNA检测的要求。阻断置换扩增（Blocker displacement amplification, BDA）技术是指通过Blocker与野生型序列更紧密结合，抑制PCR前向引物扩增野生型序列，使得突变型序列被放大数千数万倍。结合BDA技术与Sanger测序，不仅能够实现对低频ctDNA的检测，同时具备未知变异的检测能力。
该研究共纳入195名肺癌患者，分别使用BDA Sanger和Super-ARMS检测ctDNA EGFR突变情况。结果显示Super-ARMS检测到34.4%的患者存在EGFR突变，BDA Sanger检测出41.0%的患者存在EGFR突变，BDA Sanger与Super-ARMS检测结果的总体一致率为82%，19del检出的一致率为95%，L858R为93%，T790M为94%，20ins为99%，L861Q为99%，BDA Sanger与Super-ARMS具有较高的一致性。此外，BDA Sanger技术针对各个不同类型的EGFR突变均有更高的检出率。BDA Sanger和Super-ARMS检测EGFR突变的一致性针对所有样本进行BDA Sanger、 Super-ARMS和NGS三种方法的两两验证，至少有两种方法检测到的变异判定为真阳性（True Positive, TP），至少两种方法未检测到的变异判定为真阴性（True Negative, TN）。BDA Sanger检出TP的样本是89个，Super-ARMS检出TP的样本是76个。BDA Sanger的灵敏度为97.80%，特异性为98.42%；Super-ARMS的灵敏度为85.39%，特异性为99.07%。BDA Sanger和Super-ARMS的灵敏度和特异性此外，一例BDA Sanger检测阳性、Super-ARMS检测阴性的样本，经NGS复核其存在突变，并且为L858R稀有变异（2572_2573 delinsAG）。BDA Sanger可检测到2572_2573 delinsAG变异，该位点变异在蛋白水平依旧是L858R突变，此情况可使患者从EGFR TKI治疗中获益。因变异在Super-ARMS的引物识别位点之外，Super-ARMS对突变型序列无法有效扩增而被判读为野生型序列。BDA技术仅抑制野生型序列，对于多种不同突变型序列均可进行富集，在鉴定局部范围内的稀有突变位点方面具有更显著的优势。BDA Sanger、NGS、Super-ARMS检测EGFR L858R稀有变异（2572_2573 delinsAG）BDA Sanger通过创新性地结合阻断置换扩增（BDA）技术与Sanger测序，突破性地实现一代测序在ctDNA检测中的应用。利用肺癌临床队列，首次验证了BDA Sanger技术在ctDNA EGFR检测中的临床有效性与实用性。相比于国内外获批的Super-ARMS方法，BDA Sanger技术能够检出更多的未知突变，为肺癌患者的临床诊疗提供额外的有效价值，我们也期待BDA Sanger在临床检验中拓展出更加广泛的应用前景。
